彩票网站送彩金

【獲獎論文】降鈣素基因相關肽對骨質疏松性骨折愈合影響的體外研究

發布時間:2017-11-23

文章來源:中華骨科雜志, 2017,37(06) : 353-359|||作者:梁偉 呂天成 李理 李兵 

摘要  

目的

探討降鈣素相關基因肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)對骨質疏松大鼠的骨髓基質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化能力及其血管內皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)增殖的影響,及其促進骨質疏松性骨折愈合的細胞分子學作用機制。


方法

彩票网站送彩金取3月齡SD大鼠10只,予雙側卵巢切除術制作骨質疏松模型,術后6個月予顯微CT(Micro-CT)行骨密度檢測,確定建模成功;后采用全血貼壁法分離骨質疏松性大鼠的BMSCs及VECs;在細胞培養液中加入不同濃度(1×10-7~1×10-10 mol/L)的CGRP,采用細胞增殖檢測(CCK-8)法檢測細胞增殖能力;CGRP對骨質疏松大鼠BMSCs成骨分化能力的影響:通過堿性磷酸酶活性檢測及逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、重組人骨形態發生蛋白2、骨黏連蛋白、RunX2蛋白等成骨相關細胞基因mRNA的表達。CGRP對骨質疏松大鼠VECs血管化的影響:采用ELISA、RT-PCR法分別檢測細胞內皮細胞生長因子(vascular cell endothelial growth factor,VEGF)的蛋白分泌和基因表達水平。


結果

彩票网站送彩金成功分離培養出骨質疏松大鼠BMSCs;CCK-8法測定細胞增殖能力,CGRP對BMSCs細胞的影響:CGRP各濃度組較對照組均增加,且呈劑量依賴關系,7 d時對照組OD值為0.58±0.02,CGRP組中10-7~10-10 mol/L分別為0.80±0.03,0.79±0.03,0.74±0.03,0.69±0.03,與對照組的差異均有統計學意義;CGRP對VECs細胞的影響:對照組OD值為2.20±0.01,CGRP組中10-7~10-10 mol/L分別為4.12±0.04,3.90±0.02,3.56±0.04,3.12±0.04,與對照組的差異均有統計學意義。堿性磷酸酶活性檢測及RT-PCR方法檢測堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原、重組人骨形態發生蛋白2、骨黏連蛋白、RunX2蛋白等成骨相關細胞基因mRNA的表達,對照組與CGRP應用的各濃度組的差異均有統計學意義。


結論

10-7~10-10 mol/L的CGRP可以促進骨質疏松大鼠BMSCs及VECs增殖,且呈濃度依賴性,并能促進BMSCs的成骨分化、細胞VEGF基因表達及蛋白的分泌、血管生成。


彩票网站送彩金骨質疏松癥是一種常見的骨科代謝性疾病,由骨質疏松引發的骨折發病率逐年增高。骨質疏松性骨折多發生于老年人,屬于病理性骨折,因骨質量差,骨折初始固定不牢固、穩定性差、骨折愈合過程緩慢、恢復時間長,易發生骨折延遲愈合甚至不愈合等系列問題,針對骨質疏松性骨折原因及愈合的相關研究已成為熱點[1]。成骨細胞的增殖及分化和骨折局部血管化是促進骨質疏松性骨折愈合的關鍵因素,而骨髓基質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)在特異因子誘導下,具有向多種細胞系分化的潛能,可分化為骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、血管內皮細胞、神經元樣細胞、脂肪細胞、胰島β細胞等。如BMSCs成脂分化能力增強而成骨分化能力降低,可致骨質疏松,表現為骨量減少與髓腔內的脂肪增多[2]。如何使BMSCs成骨分化能力增強,成為骨質疏松性骨折的研究方向。


彩票网站送彩金近年來,神經系統對骨組織代謝的作用的相關研究受到越來越多的重視,神經纖維末梢可以通過釋放多種神經遞質分子如鈣素相關基因肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)、神經肽、P物質等發揮作用。在骨組織周圍分布著大量CGRP陽性神經纖維,這些神經纖維可分泌CGRP調節細胞功能,并增加骨折局部供血。CGRP表達強度提高,有利于刺激骨折愈合過程中各種細胞的遷移、增殖及分化,形成大量的骨性骨痂和軟骨痂[4]。另外,CGRP參與調節骨折局部的多種細胞功能,對骨折愈合過程中骨痂的血管生成也有促進作用,可刺激骨折微環境下血管內皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)增殖,加速血管生成,增加局部血流;同時促進骨折愈合過程中BMSCs增殖,刺激細胞內成骨相關基因的表達,增加堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性,促進細胞向成骨細胞分化及礦化,刺激骨痂的生長[3,4]。但CGRP能否加速骨質疏松骨折的病理環境下的血管化,并促進BMSCs增殖及分化仍然需要進一步研究。


本研究使用卵巢切除法制造骨質疏松大鼠模型,提取BMSCs及VECs,在體外與不同濃度CGRP共培養,觀察CGRP對骨質疏松大鼠BMSCs及VECs細胞的影響,目的在于:①明確CGRP是否可對病理性BMSCs的增殖及成骨分化及VECs的成血管化起到促進作用;②初步探討CGRP促進骨質疏松性骨折愈合的細胞分子作用機制。


材料與方法

彩票网站送彩金一、建立骨質疏松動物模型


彩票网站送彩金取10只3月齡雌性SD大鼠(廣西醫科大學實驗動物中心提供),體重220~260 g,隨機分為兩組:雙側卵巢切除術組(ovariectomy組,ovx組)5只,采用雙側卵巢切除術建立骨質疏松模型;假手術組(sham operation組,sham組)5只,僅切除少許脂肪組織。


彩票网站送彩金術后6個月行顯微CT(Micro-CT)掃描檢測股骨相對骨體積(bone volume/tissue volume,BV/TV)和骨密度(bone mineral density,BMD)確認骨質疏松模型是否建立成功。


二、材料和試劑


本研究中采用α-杜爾伯科改良伊格爾培養液(α-DMEN,#11320-033,Gibco公司,美國),胎牛血清(FBS,#16000-044,Gibco公司,美國),DMEM/F12培養液(# 11330057,Gibco公司,美國),細胞培養板(Coming公司,美國),CCK-8(#PA5-32348,Life technologies公司,美國),ALP染色試劑盒(#AP0100-1KT,Sigma公司,美國),TRIzol試劑盒(#15596-066,Invitrogen公司,美國),CGRP(#C2806,Sigma公司,美國),VEGF ELISA試劑盒(#ERVEGFACL,Gibco公司,美國)。


彩票网站送彩金三、分離提取BMSCs


取骨質疏松動物模型,分離雙側股骨及脛骨,去除周圍軟組織,兩端開槽后用α-DMEN培養液沖洗骨髓腔數次,1 600 r/min離心6 min后棄上清,用含體積分數10%胎牛血清的α-DMEN培養基(含1%青霉素和鏈霉素)重懸細胞,接種于25 cm培養瓶內,37 ℃、體積分數為5%的CO2條件下孵育,隔天換液體積分數為0.25%胰蛋白酶消化傳代至第三代為實驗用細胞。


彩票网站送彩金四、VECs的分離與培養


彩票网站送彩金取骨質疏松動物模型,無菌條件下開胸取出胸主動脈及周圍軟組織,暴露主動脈內膜,結扎動脈兩端后用燒熱的鑷子燙烙,置于50 ml鋪有鼠尾膠培養瓶中培養,采用含體積分數20%胎牛血清的DMEM/F12培養液培養,6 d后換液并棄置主動脈,觀察細胞鋪滿瓶底80%時候,體積分數0.25%胰蛋白酶消化傳代。


彩票网站送彩金五、CCK-8檢測細胞增殖


彩票网站送彩金培養基稀釋BMSCs及VECs,并以1×104個/孔接種于96孔細胞培養板,24 h后換入不同濃度CGRP的培養液200 μl,設立不含CGRP培養液為對照組。采用CCK-8法在波長450 nm下檢測第1、3、5、7天的光密度值以了解細胞的增殖情況。每組重復5個樣本。


彩票网站送彩金六、BMSCs的成骨分化




(一)ALP活性


將BMSCs以2×104/孔接種于24孔細胞培養板,24 h后換入單純培養液及含不同濃度CGRP的培養液。使用ALP試劑盒法檢測第1、3、7、14天的ALP活性表達。每組重復5個樣本。


(二)BMSCs成骨相關基因檢測


彩票网站送彩金使用TRIzol試劑盒提取細胞的RNA,常規行反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)實驗,檢測第1、3、7、14天細胞成骨基因的表達情況。


彩票网站送彩金ALP引物:上游5’-CGTTGACTGTGGTTACTGCTGA-3’,下游5’-TTGTAACCAGGCCCGTTG-3’;BMP-2引物:上游5’-CGTGCTCAGCTTCCATCAC-3’,下游5’-CCTGCATTTGTTCCCGAAA-3’。


RunX2引物:上游5’-TTTGCAGTGGGACCGACA-3’,下游5’-AGCCATGGTGCCCGTTAG-3’。


Ⅰ型膠原蛋白引物:上游5’-TCTCCATGGCCTCTGCAA-3’,下游5’-CATGTGTGGCCGATGTTTC-3’。


骨黏連蛋白引物:上游5’-CTCCCATTGGCGAGTTTG-3’,下游為5’-TGTAGTCCAGGTGGAGCTTGTG-3’。


內參選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物:上游5’-CACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’,下游5’-GGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。每組測試5個平行樣本。


七、VECs的血管內皮因子的分泌



彩票网站送彩金(一)ELISA法檢測細胞分泌血管內皮因子水平


第三代VECs稀釋到2 ml細胞培養液中,添加到12孔細胞培養板,24 h后換入含不同濃度CGRP的培養液作為實驗組,并設對照組。繼續培養第1、2、3天后分別收集上清液,采用ELISA檢測試劑盒方法進行檢測血管內皮細胞生長因子(vascular cell endothelial growth factor,VEGF)水平。每組設5個平行樣本,比較各組細胞分泌VEGF水平。


(二)PCR法檢測VECs中VEGF的表達水平


骨質疏松大鼠VECs在CGRP實驗組及sham組中培養1、2、3 d后,用TRIzol法收集各組細胞的RNA,用光譜儀檢測其純度和濃度。

彩票网站送彩金設計合成RNA引物:VEGF引物:上游5’-ACTCGCCCTCATCCTCTTCC-3’,下游5’-TCAACACACTCACACACACAAC-3’;內參選用β-Actin引物:上游5’-TGGCACCCAGCACAATGAA -3’,下游5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAA GCA-3’。


彩票网站送彩金使用TRIzol法進行總RNA抽提,反轉錄為cDNA,PCR反應條件優化,隨后采用SYBR GreenⅠ染料法進行RT-PCR檢測,按照試劑盒說明書配好反應體系,上機進行擴增和檢測。循環結束后進行融解曲線繪制。每組測試5個平行樣本。


八、統計學分析


采用SPSS 19.0(SPSS公司,美國)統計學軟件包進行統計學處理。計數資料采用均數±標準差(±s)的形式表示,CGRP實驗組(10-7~10-10 mol/L)與對照組的ELISA及PCR數據的比較采用Students’成組設計資料t檢驗,檢驗水準α值取雙側0.05。


結果

彩票网站送彩金一、骨質疏松大鼠模型


彩票网站送彩金經Micro-CT分析結果顯示術后6個月sham組BV/TV為17.1%±2.5%,ovx組為3.4%±0.9%,sham組較ovx組多13.7%,差異有統計學意義;sham組BMD為(0.343±0.030)g/cm2,ovx組(0.183±0.019)g/cm2,sham組較ovx組多0.12 g/cm2,差異有統計學意義。


二、CCK-8法檢測細胞增殖


彩票网站送彩金細胞培養1 d后各實驗組及對照組之間無明顯差異,在第3、5、7天,CGRP各組細胞較對照組均顯著增加,差異均有統計學意義。


7 d后對照組OD值0.58±0.02,CGRP組中10-7~10-10 mol/L各組分別為0.80±0.03,0.79±0.03,0.74±0.03,0.69±0.03,各組與對照組比較,差異均有統計學意義。10-7mol/L組的BMSCs增值率為較對照組提高了約30%,在實驗組各個濃度CGRP的組內比較發現,10-7 mol/L組增殖最快,這說明細胞增殖與CGRP的濃度在10-7~10-10 mol/L之間呈劑量依賴型(圖1A)。


圖1 細胞增殖實驗結果 A CGRP對BMSCs細胞增殖的影響,采用CCK-8法檢測,不同濃度的CGRP(10-10~10-7mol/L)均可促進細胞增殖,且呈濃度依賴性 B CGRP對VECs細胞增殖的影響,不同濃度的CGRP均可促進細胞增殖,且呈濃度依賴性


彩票网站送彩金CGRP對VECs細胞增殖的影響檢測發現:對照組OD值2.20±0.01,CGRP濃度10-7~10-10 mol/L各組分別為4.12±0.04,3.90±0.024,3.56±0.04,3.12±0.04,各組與對照組的差異均具有統計學意義(圖1B)。


彩票网站送彩金三、CGRP對BMSCs細胞成骨分化的影響


7 d后ALP對照組為1.000±0.205,CGRP濃度10-7 mol/L組為2.578±0.210,CGRP濃度10-10 mol/L組為2.351±0.201;BMP-2對照組為0.980±0.200,CGRP濃度10-7 mol/L組為3.428±0.255,CGRP濃度10-10 mol/L組為2.915±0.202;COLL-Ⅰ對照組為1.030±0.202,CGRP濃度10-7 mol/L組為2.519±0.240,CGRP濃度10-10 mol/L組為2.348±0.201;RunX2對照組為0.993±0.213,CGRP濃度10-7 mol/L組為2.499±0.262,CGRP濃度10-10 mol/L組為2.220±0.250;骨黏連蛋白對照組為1.020±0.200,CGRP濃度10-7 mol/L組為1.973±0.212,10-10 mol/L組為1.864±0.250,各組與對照組的差異有統計學意義。


彩票网站送彩金14 d后ALP對照組為0.005±0.000,CGRP濃度10-7~10-10 mol/L組分別為0.044±0.002,0.042±0.003,0.039±0.001,0.025±0.001,各組與對照組比較的差異有統計學意義。


細胞ALP活性檢測結果顯示:CGRP作用于細胞7、14 d,含不同濃度CGRP的實驗組較對照組ALP活性增加,差異有統計學意義,7 d時10-7 mol/L組的堿性磷酸酶活性較對照組提高了約一倍,提示CGRP早期可以促進BMSCs成骨分化(圖2)。PCR基因檢測結果顯示CGRP能增加成骨分化的早期ALP和COLL-Ⅰ基因的表達,同時促進成骨分化晚期BMP-2,骨黏連蛋白和RunX2基因的表達(圖3)。


圖2 CGRP對BMSCs細胞分泌ALP活性檢測,隨時間增加,不同濃度CGRP(10-10~10-7 mol/L)均可促進細胞分泌ALP,且呈濃度依賴性

彩票网站送彩金圖3 成骨相關基因的PCR檢測結果 A 隨著時間推移,CGRP上調ALP的表達,且10-10 mol/L組的表達水平高于10-7 mol/L組 B 隨著時間推移,CGRP上調BMP-2的表達,且10-10 mol/L組的表達水平高于10-7 mol/L組 C 隨著時間推移,CGRP上調COLL-Ⅰ的表達,且CGRP濃度10-10 mol/L組的表達水平高于10-7mol/L組 D 隨著時間推移,CGRP上調骨黏連蛋白的表達,且10-10 mol/L組的表達水平高于10-7 mol/L組 E 隨著時間推移,CGRP上調RunX2的表達,且10-10 mol/L組的表達水平高于10-7 mol/L組


四、CGRP對VECs的VEGF的分泌的影響


彩票网站送彩金采用VEGF-ELISA試劑盒檢測細胞受CGRP刺激培養1、3、5、7 d后培養液中細胞分泌VEGF水平,7 d后對照組VEGF濃度為3.218±0.314,CGRP濃度10-7~10-10 mol/L分別為5.579±0.564,4.792±0.159,4.721±0.358,4.675±0.112,各組與對照組的差異均有統計學意義。含不同濃度CGRP的實驗組的VEGF水平均明顯高于對照組,由此說明釋放CGRP促進VECs分泌VEGF(圖4)。


圖4 CGRP對血管內皮細胞分泌VEGF的結果,通過ELISA法檢測發現,隨著時間的增加,不同濃度的CGRP(10-10~10-7mol/L)均可刺激細胞分泌VEGF,且呈濃度依賴性


彩票网站送彩金PCR檢測細胞中VEGF基因表達水平:7 d后對照組VEGF濃度0.999±0.008,CGRP濃度10-7 mol/L為4.433±0.182,10-10 mol/L為4.121±0.195,各組與對照組的差異均有統計學意義。各時間點CGRP實驗組VEGF-mRNA的表達水平均較對照組增高,結果與ELISA檢測結果相同。無論是VEGF基因表達水平,還是蛋白分泌水平,CGRP實驗組均明顯高于對照組(圖4,圖5)。

彩票网站送彩金圖5 VEGF mRNA的表達,通過RT-PCR檢測發現CGRP可上調細胞中VEGF mRNA的表達,且10-7 mol/L的表達量最高

討論

一、骨質疏松性骨折的特點


骨組織是一種復雜的動態組織,在其不斷的新陳代謝過程中,成骨細胞與破骨細胞是最關鍵的兩種細胞,它們的共同作用調節骨組織代謝。骨組織周圍還伴行著大量的血管及神經。因此,骨組織的修復過程,其實是神經對骨組織的調控下及血管對骨組織的能量供應的前提下,機體各類細胞之間錯綜復雜的作用。由此可見,血液的供應和神經支配的重建是促進骨折愈合、保持骨折局部修復區域內環境的生物學穩定性關鍵因素之一。而由骨質疏松癥造成的骨折、骨不愈合等一直是威脅人類生命健康的醫學難題。骨質疏松骨微環境下,成骨細胞的功能減弱,而過渡活躍的破骨細胞抑制了成骨細胞的活力。同時,骨髓基質干細胞成脂分化能力增強而成骨分化能力減弱,最終導致骨形成減少。


二、CGRP對骨折愈合的作用


彩票网站送彩金CGRP代表一類具有多功能的神經肽,其由37個氨基酸組成的多肽,并由上級神經調控,在脊髓后根神經節神經元內合成,通過軸漿運輸的方式到達感覺神經纖維的末梢,以分泌顆粒的形式儲存在胞漿中,隨著神經末梢分布于周圍器官[5,6]。在血管內皮細胞、骨髓基質干細胞、成骨細胞、破骨細胞等這些與骨組織代謝直接相關的細胞表面均存在CGRP受體[7]。CGRP能與這些細胞表面的CGRP受體特異性的結合,發揮作用。在骨折局部環境中新生成的骨組織及骨膜組織上CGRP的陽性纖維大量增加,導致血漿CGRP濃度明顯增加[8,9]。神經系統可通過分泌CGRP來參與調節骨折局部的細胞功能,包括增加骨折局部供血;促進BMSCs及成骨細胞增殖及分化來增強骨修復效果[10,11,12,13,14]。


彩票网站送彩金三、CGRP對骨質疏松性骨折愈合的作用


目前研究CGRP對骨組織的影響大多是基于健康細胞株,對于骨質疏松性環境下的研究甚少。本研究成功分離提取骨質疏松大鼠的BMSCs及VECs,體外用CGRP刺激細胞,從細胞的增殖,細胞外基質的改變及細胞內基因的變化來分析其對細胞的作用。CGRP早期能促進BMSCs的增殖,后期能刺激BMSCs分泌ALP,促使細胞向成骨分化。因此,考慮CGRP對BMSCs細胞成骨分化過程中的各個階段均有作用。CGRP促進BMSCs細胞的增殖,以產生足夠多的前體細胞,然后其在后期逐漸刺激細胞向成骨細胞分化。然而CGRP在細胞成骨分化過程中的作用機制仍然不是很清楚。本研究從細胞內基因的層面,探討CGRP對細胞的作用機制。目前已有許多研究者對BMSCs的成骨分化過程中的相關基因表達進行研究[7],發現ALP、COLL-Ⅰ、骨鈣素、骨黏連蛋白、BMP等為較關鍵的基因。本研究中,使用RT-PCR檢測CGRP誘導細胞內BMP-2、RunX2、COLL-Ⅰ、ALP及骨黏連蛋白的mRNA表達,發現CGRP可刺激細胞上述基因及蛋白的表達,且差異有統計學意義。因此,CGRP可激活細胞內BMP-2信號通路途徑,上調RUNX2基因的表達,RunX2隨后啟動成骨細胞特異性基因的表達,如ALP、COLL-2等,促進細胞外基質逐漸成熟使BMSCs向成骨細胞分化。而CGRP也能刺激細胞內VEGF基因的表達,提高細胞分泌VEGF,進而促進細胞的增殖,形成新生血管。


彩票网站送彩金綜上所述,本實驗分離培養出骨質疏松大鼠BMSCs及VECs,并證實CGRP能刺激血管內皮細胞的增殖和血管生成,改善骨組織中的神經血管微環境,并提高病理性BMSCs增殖的同時促進其向成骨細胞分化,為血供環境差及成骨能力弱的骨質疏性骨損傷的治療提供一定的理論基礎,將CGRP應用于骨折修復可能是骨組織工程治療骨質疏松性骨折一個新的方向。但骨折愈合涉及多種因素,CGRP應用于臨床治療前還需做更多、更深入的體外細胞實驗和動物實驗以驗證其可行性及安全性。


彩票网站送彩金電話:010-81543859

郵箱:mzxue999@163.com

地址:北京市通州區新華北路117號院國資委大院內11幢3樓76室

北京安通醫療器械有限公司 臭氧治療儀專賣 網站地圖

 
聯系方式
010-81543859
18601128931